胶质母细胞瘤(GBM)是成人最常见和最致命的原发性恶性脑肿瘤，在过去的20年里，尽管出现了许多新的治疗方法，但除了标准疗法(手术、放疗和替莫唑胺)之外，胶质母细胞瘤的临床治疗计划仍然不可用。目前，替莫唑胺(TMZ)是延长GBM患者总生存期的化疗药物，因其烷基化DNA的能力而被报道为传统疗法的基石。但是，由于其高度异质性和易突变性，它也是肿瘤耐药性和复发的关键因素。因此，迫切需要确定克服TMZ阻力和提高其治疗效果的更好方法。
近期，天津市环湖医院闫华教授-佟小光教授-徐立霞副研究员团队在Cancer Letters（IF 9.7）期刊上发表了题为“Ultrasound-excited temozolomide sonosensitization induces necroptosis”的文章。该研究首次发现TMZ在超声(US)的影响下会产生活性氧(ROS)。这一特性使得TMZ-US疗法在GBM治疗中具有更好的疗效。鉴于US在中枢神经系统(CNS)疾病中的使用日益增多，以及TMZ对GBM治疗的重要性，有助于TMZ对相关胶质母细胞瘤治疗的发展。中科新生命为该研究提供了4D Labelfree蛋白质组学技术服务。
研究材料
替莫唑胺(TMZ)、人胶质母细胞瘤（GBM）细胞
技术路线
步骤1：TMZ-US在体外增强TMZ对胶质瘤的化疗敏感性；
步骤2：TMZ-US在体内增强抗肿瘤作用；
步骤3：差异甲基化基因和差异表达基因的综合分析；
步骤4：TMZ-US通过增加ROS诱导胶质瘤细胞的坏死凋亡；
步骤5：TMZ-US不能诱导线粒体依赖性细胞凋亡。
研究结果
1. TMZ-US在体外增强TMZ对胶质瘤的化疗敏感性
在本研究中，作者采用不同浓度的TMZ联合相同超声处理TBD、LN229、U87、U251、TMZ耐药的U87/R和U251/R细胞。然后比较IC50值以确定联合治疗的致敏效果。CCK-8结果提示TMZ-US显著增加了胶质瘤细胞的抑制率，并显著降低了TMZ的IC50。同时，作者还检测了细胞凋亡或坏死率和入侵能力，并观察到TMZ-US组显示出比US和TMZ组更高的细胞凋亡或坏死率，侵袭能力更低。ATP浓度的测定也获得了类似的结果。研究表明，ROS在肿瘤细胞中的积累会导致生物分子的氧化，破坏脂质膜和蛋白质的完整性。因此，我们检查了C11-BODIPY581/591的含量并在TMZ-US组中观察到膜脂质过氧化的显著增加。这些结果表明，TMZ-US破坏了线粒体膜电位，导致膜脂质过氧化，细胞功能受损（图1）。
图1 TMZ+US增强TMZ的化疗敏感性
2.TMZ-US在体内增强抗肿瘤作用
作者随后评估联合治疗对皮下肿瘤和神经胶质瘤的抑制作用,与TMZ组相比，使用TMZ-US治疗皮下肿瘤时，观察到肿瘤生长受到显著的抑制。当治疗患有颅内胶质瘤的小鼠时，TMZ-US联合治疗组的体内改善结果显示出比TMZ组进一步抑制肿瘤生长速率。相反，荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存曲线显示显著延长的存活率。因此，为了了解联合治疗的毒性作用，研究人员同时监测了体重变化。结果表明，两组之间的体重变化无显著差异。此外，免疫组织化学染色显示，TMZ-US增加了肿瘤组织中的DNA损伤(γ-H2AX)和凋亡(裂解的caspase3)，并降低了与细胞增殖和侵袭相关的多种指标的表达，包括Ki67、MMP2和N-Cadherin，这些结果表明，TMZ-US疗法增强了DNA的TMZ损伤，诱导了更高的凋亡和更低的侵袭性(图2)。
图2 TMZ+US联合比TMZ治疗能更好地抑制肿瘤生长
3. 差异甲基化基因和差异表达基因的综合分析
作者使用多组学分析来探讨TMZ-US对胶质瘤细胞产生的影响。转录组学分析TMZ-US诱发的肿瘤死亡机制。首先，对比NC、TMZ和TMZ-US，结果识别出5005个差异。KEGG对这些差异表达基因的富集分析显示，TNF信号通路与TMZ-US效应关系最为密切。接下来，为了进一步研究TMZ-US疗法的机制，进行了多组学分析。基于RNA-seq的KEGG结果，分析了肿瘤坏死因子(TNF)的启动子甲基化。结果表明，与TMZ组相比，该启动子发生了超甲基化。最后，对TMZ-US和TMZ-US的DEGs进行了综合分析。综合多组学分析和实验结果，可以发现TMZ-US引起TNF-α表达水平升高，这可能与其启动子甲基化水平降低有关。此外，也发现坏死凋亡得到富集（图3）。
图3 WGBS与RNA-seq的综合分析
4. TMZ-US通过增加ROS诱导胶质瘤细胞的坏死凋亡
根据综合分析结果，探查了细胞坏死性凋亡，以确定原发性细胞损伤是否由TMZ-US引起。首先，我们使用了各种细胞死亡抑制剂来探查TMZ-US治疗后的细胞死亡模式。发现在较高的TMZ浓度下，细胞出现坏死性下垂。进一步探索了联合治疗后不同抑制剂浓度对细胞的作用,Nec-1和NAC对TMZ-US诱发的细胞死亡具有剂量依赖性效应。ROS水平升高导致TMZ-US诱导的坏死凋亡。进行Western blotting分析结果显示，TMZ-US上调了p-RIP1、p-RIP3、p-MLKL或RIP1、RIP3、MLKL，但NAC阻止了这种上调。此外，在ATP浓度测定中也获得了类似的结果。这些结果均表明TMZ-US激活ROS诱导细胞坏死凋亡(图4)。
图4 TMZ + US通过增加活性氧诱导胶质瘤细胞坏死
5. TMZ-US不能诱导线粒体依赖性细胞凋亡
为进一步探索TMZ-US对线粒体依赖性凋亡的影响。研究人员对细胞色素c与线粒体共定位和线粒体蛋白质组学研究。得出以下结论: 1、TMZ-US主要影响细胞核内的位点；2、TMZ-US不影响与线粒体依赖性凋亡有关的蛋白；3、TMZ-US主要影响生物过程(图5)。
图5 TMZ-US不能诱导线粒体依赖性细胞凋亡
文章小结
本研究提出了TMZ对GBM的超声动力化疗。本文通过理论计算和实验证实TMZ可能是一种超声作用下产生ROS的声敏剂。此外，TMZ-US在体内和体外均可增强TMZ化疗疗效，逆转TMZ耐药。最终，通过多组学综合分析并实验验证，TMZ-US主要通过ROS诱导胶质瘤细胞的坏死凋亡发挥抗肿瘤作用。本文工作主要在天津市环湖医院神经外科研究所完成。文章的第一作者分别是王钒臣（天津医科大学研究生）、徐立霞、闻斌礼（天津医科大学研究生）；通讯作者是闫华、佟小光、王银松（天津医科大学）。
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